Новости науки 21.06.02. Хроматография сверхвысокого разрешения

"Широко распростерла руки свои хроматография в дела человеческие..." - можно с уверенностью заявить, перефразируя Д.И. Менделеева. От допинг-контроля участников чемпионата мира по футболу или высококачественных тестов на беременность, до проверки качества бензина на автозаправках - все это хроматография.

В основе метода - разделение веществ при их перемещении через слой специального сорбента (силикагель, пористое стекло и т.д.), то есть материала, способного обратимо связывать компоненты смеси. Сорбент может быть помещен в колонку, представляющую собой калиброванную трубку (колоночная хроматография) или тонким слоем располагаться на специальной пластинке (тонкослойная хроматография). Компоненты смеси, связывающиеся сильнее, задерживаются и появляются на выходе колонки позже компонентов, связывающихся слабее. Блок-схема хроматографа представлена на рисунке 1.

В идеале каждое вещество в результате разделения смеси выходит отдельно и представляется в виде отдельного пика. Однако на практике, разделение компонентов далеко не полное, а хроматограмма (Рис. 1) представляет собой сумму пиков, многие из которых накладываются друг на друга. Это затрудняет количественный анализ смеси. Улучшение разделения достигается либо применением новых более совершенных сорбентов, либо с помощью расчетных методов. В основе применяемых сегодня расчетных методов, лежит предположение о том, что форма пика индивидуального вещества может быть описана аналитически, например, с помощью функции Гаусса. Зная вид такой функции, можно вычленить отдельные пики на хроматограмме. Это, так называемый, параметрический подход.

Однако, наблюдаемая на опыте форма пика, как правило, даже не входит в обширный набор функций (Гаусс, Лоренц, и т.д.) программных пакетов, используемых в хроматографии. Более того, форма пика индивидуального соединения вследствие необратимых изменений в колонке со временем существенно искажается. Именно поэтому параметрический метод не может дать надежных результатов.

Авторы работы "Хроматография сверхвысокого разрешения" [1] предлагают разрешить проблему разделения перекрывающихся пиков с помощью непараметрического метода. Форма пика при этом определяется непосредственно при хроматографии индивидуального соединения. Ясно, что, полученная таким образом, форма пика отражает все особенности данной колонки и может быть названа аппаратной функцией хроматографической колонки.

Хроматограмма смеси веществ может быть представлена как суперпозиция индивидуальных пиков одинаковой формы. Задача разложения сложного спектра на одинаковые составляющие достигается решением интегрального уравнения свертки. Для решения такого уравнения необходимо наличие собственно хроматограммы и знание аппаратной функции хроматографической колонки. Оба эти параметра выражаются просто в виде ряда чисел, например, значений оптической плотности растворителя на выходе колонки.

Специально разработанный пакет программ восстановления сигналов из зашумленных данных RECOVERY был успешно применен для разложения реальной хроматограммы на составляющие компоненты. Авторы провели следующий эксперимент: смесь белков известного состава (мономер, димер и тример бычьего сывороточного альбумина) разделялась с применением сорбента (TSK-gel, HW-55), который, как было известно заранее, в принципе не был способен разделить по массам указанную смесь, то есть в результате разделения получалась хроматограмма с сильно перекрывающимися пиками. Данные обрабатывались с помощью программного комплекса RECOVERY, а результат сравнивался с данными более тонкого разделения, полученными с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

На рисунке 2А показаны хроматограммы бычьего сывороточного альбумина (БСА) (синяя линия) и результат восстановления данных хроматографического разделения с помощью программы RECOVERY (красная линия). Точность определения компонентов смеси составила 5%. На рисунке 2В представлены данные по разделению того же самого образца БСА с помощью ВЭЖХ.

Таким образом, показано, что предложенный метод значительно улучшает качество хроматографического разделения, и позволяет количественно измерять содержание отдельных компонентов смеси. Результат существенно превысил качество разделения, достигаемое с помощью ВЭЖХ, и достиг сверхразрешения. То есть ширина полученных пиков оказалась уже, чем ширина аппаратной функции.

Следует отметить, что стоимость использованного приборного комплекса для гель-фильтрации (около $1000) примерно в 20 раз меньше, чем стоимость установки для ВЭЖХ.

Авторы полагают, что развитие этого метода позволит существенно снизить стоимость хроматографического анализа, как за счет упрощения приборов, так и за счет сокращения времени анализа.

перейти к началу страницы